异丙基硫杂蒽酮(ITX)属硫杂蒽酮类化合物 , 是目前食品纸质包装材料中使用较多的一种自由基型高分子光引发剂, 在紫外光固化油墨中的主要作用是利用其感光基团在光吸收过程中产生活性成分,引发单功能、多功能的单体和预聚合体(如乙烯基聚合物)的聚合交联反应[ 1, 2 ] 。在2005年的雀巢婴儿牛奶事件中,由于检测到包装材料印刷油墨中的ITX渗入牛奶中,导致雀巢公司从法国、葡萄牙、西班牙及意大利召回大批产品[ 3 ] 。国内还没有相关问题的报道。目前, 世界卫生组织(WHO )公布的威胁人类健康的物质清单中还未将ITX列入其中,欧盟相关规定也没有禁止ITX用于食品包装材料[ 4 ] , 我国也未将ITX列入《食品容器包装材料用助剂使用卫生标准目录》的65种可使用的添加剂之中[ 5 ] 。由欧洲食品安全权利机构( ESFA)提供的毒理学试验结果表明该化合物并不具有遗传毒性,但是其他方面的毒性研究还缺乏相关的数据,其安全性还有待进一步论证[ 6 ] 。但是在已有的研究中,还未有牛奶包装材料中迁移的ITX分析方法的报道。因此, 在食品安全问题和国际环境逐渐接轨的形势下, 开发相关的确证和定量方法就显得尤为重要。欧盟在2002 /657 /EC 决议中[ 7 ]对于痕量物质的确证要求包括其化学结构的信息,因此质谱也就成为首选方法。
本文提出了针对乳制品中ITX的筛选和确证方法,采用气相色谱2质谱法(GC2MS )在选择离子模式(S IM )下对所选样品进行筛选, 疑似样品采用气相色谱2串联质谱法(GC2MS /MS)进行确证,并利用该方法对目前市场上11种不同品牌和类型的乳制品中ITX的残留量进行了检测,结果表明该方法能够满足实际分析的要求。
1 实验部分
1. 1 仪器、试剂和样品
Varian公司CP3800 /Saturn 2200气相色谱-离子阱串联质谱仪( GC-MS /MS ) ; Agilent 公司HP6890 /5973气相色谱-单四极杆质谱仪( GC-MS ) ;B uchi公司Ro tavap o r R-250 真空旋转蒸发器(附
B uch i公司Hea ting B a th N -490 水浴锅) ; HZQ -C振荡器; Epp endo rf Cen trifuge 5810R 离心机; N-EVAP III恒温氮吹装置(O rganom a tion Associates公司) ; 氟罗里硅土固相萃取( SPE ) 柱( Su lp eco,500mg, 6mL ) ; Supelco固相提取装置。
异丙基硫杂蒽酮标准品( 2-, 4-异构体混合物,纯度≥ 98%) 为美国Ald rich 产品; 氘代蒽( 10ng /μL )为德国D r. Eh rens tofe r Gm bh 公司产品;正己烷、丙酮、氯仿、二水乙酸钠、亚铁氰化钾均为分析纯。水采用美国M illip o re 纯化系统净化。Car-rez Ⅰ溶液:称取220 g二水乙酸钠溶解于水中, 加入30 mL 无水乙酸, 用水定容至1 L; Ca rrez Ⅱ溶液:称取106 g三水亚铁氰化钾,溶解于水中, 用水定容至1 L。所用乳制品样品为上海出入境检验检疫局检验样品和超市商品。
1. 2 样品前处理
移取10 mL 牛奶样品于50 mL 塑料离心管中,加入100 ng内标, 3 mL Carrez Ⅰ溶液,混匀, 再加入2 mL Ca rrez Ⅱ溶液,混匀。然后用20 mL 体积比为1∶1的丙酮2正己烷混合液振荡提取5 m in。于4 000 r /min离心5 min 后吸取上层溶液于蒸发瓶中,于40 ℃下旋转蒸发,用2 mL 体积比为1∶1的丙酮2正己烷混合液溶解后用氟罗里硅土SPE 小柱净化。氟罗里硅土柱依次采用3 mL 丙酮、3 mL 正己烷活化后上样, 4 mL 体积比为1∶2的丙酮2正己烷混合液洗脱。洗脱液在氮气流下浓缩定容至1 mL供气相色谱分析。
1. 3 色谱条件
GC-MS/MS采用HP-1MS柱(30 m ×0125 mm×0125μm ) , GC-MS采用HP-5MS柱(30m×0125mm×0125μm )。升温程序为: 70℃( 1 min )
(10 m in ) 。二者均采用高纯He 为载气, 流速为1mL/min,进样口温度为280 ℃, 传输线温度为270℃。进样量为1μL,均为不分流进样。
1. 4 质谱条件
GC-MS/MS和GC-MS均采用电子轰击电离源(EI) ,电离能量为70 eV。GC-MS 离子源温度为250 ℃, ITX 的监测离子(相对丰度) 为: m / z 254(58%) 、m / z 239 (100%) 、m / z 224 ( 17%) 、m / z 184
(11%) ,定量离子为m / z 254。氘代蒽的监测离子(相对丰度)为m / z 188 ( 100%) 、m / z 160 ( 10%) 、m / z 94 ( 13%) 、m / z 80 ( 12%) , 定量离子为m / z188。GC-MS /MS 分析时ITX 母离子为m / z 254,
定量子离子为m / z 239, 二次电离电压为0152 V。氘代蒽母离子为m / z 188,定量子离子为m / z 160,二次电离电压为0168 V。电子倍增器电压( EMV)为自动调谐值加200 V。
1. 5 添加回收试验
移取10 mL 牛奶样品于50 mL 塑料离心管中,加入100 ng内标,按终浓度为510, 1010, 2010μg /L添加ITX标准溶液(每个浓度水平做4 个平行样品) ,混匀,其他操作步骤同“1.2”节。
2 结果与讨论
2. 1 提取与净化
ITX为淡黄色结晶粉末, 溶解于非极性溶剂如苯、正己烷等,同时在极性较强的溶剂如乙醇、丙酮中也有较好的溶解性能。由于目前包装材料所使用的ITX为2-, 4-异构体混合物,本方法采用的标准品为混合标准品,主要组分为2-ITX,两种化合物的质谱图基本一致,因此相关计算取其二者面积和质量之和。方法中的内标物为氘代蒽, 其化学结构与ITX类似,提取和净化效率认为基本相当,分子离子峰较为稳定,基质干扰小。由于乳制品中含有大量的蛋白质,对样品分析产生极大的干扰,直接采取液液萃取的方式提取效率很低。通过比较不同的蛋白沉淀剂后, 发现Ca rrez试剂效果较好, 同时在提取溶剂中加入部分丙酮有利于蛋白的沉淀。比较后发现丙酮和正己烷( 1∶1)提取液的效果最好, 通过离心一次完成去除蛋白和液液提取操作。随后经氟罗里硅土柱除去样品中主要的色素等极性杂质, 淋洗曲线结果表明4 mL 丙酮2正己烷( 2∶1)即可将待分析化合物和内标物全部洗脱, 且洗脱下的其他杂质较少。
2. 2 GC-M S 筛选方法的建立
ITX的稠环芳烃结构在E I模式下相对比较稳定,其主要的特征离子碎片分别为分子离子峰m / z254 (M )和丢失甲基的碎片峰m / z 239 (M - CH3 ) 、m / z 224 (M - 2CH3 ) 。内标氘代蒽的分子离子峰
m / z 188 (M )和丢失一分子氘代乙烯的碎片峰m / z160 (M - C2D4 )为主要特征离子。实际样品分析中发现丰度最大的离子m / z 239存在比较大的本底干扰, 而分子离子峰m / z 254的背景噪音较小, 可
以获得较高的信噪比(见图2) 。
准确添加ITX标准品至空白样品中使其终浓度为5.0, 10.0, 20.0, 50.0, 100.0μg /L,按照“1.2”节和“1.3”节步骤操作得到ITX ( 2-, 4-异构体之和)与内标峰面积的比值( y ) 和ITX 的总含量( x,μg /L )呈良好的线性关系, 线性方程为y = 0.016x- 0.0308,线性相关系数( r2 )为0.9998。信噪比大于10时,定量限(LOQ )为7.0μg /L。
按照“1.5”节操作得到回收率数据如表1,平均回收率为74.9%～89.6%, 相对标准偏差(RSD )值为11%～19%。
为11%～19%。
根据欧盟关于筛选方法的要求[ 7 ] , 疑似样品满足以下条件: ( 1)待分析物和标准物的保留时间偏差在±015%范围内; ( 2)选择离子m /z 239, m/z254, m/z 224, m/z 184 必须全部出现并且相对丰度比例变化在15%范围内。质谱图中离子强度较高的为m /z 254和m /z 239,在实际样品分析中,这两个离子的信噪比相对于m/z 224和m/z 184较
强。图2为典型的疑似阳性样品色谱图。而对于疑似的假阳性样品, 在选取离子m/z 254时, 图谱在目标化合物相应的保留时间处有干扰峰存在, 而m/z 239的基质干扰较强,无法辨别。因此,对于实际样品分析中发现的疑似阳性样品需采用GC-MS/MS方法来进行确证。
2.3 GC-MS/MS 确证方法的建立
分别选取了ITX和内标氘代蒽的丰度较大的分子离子峰(m/z 254和m/z 188)作为母离子来进行MS/MS 条件优化, 图3和图4分别为ITX和氘代蒽的一级和二级全扫描质谱图, 可以看到分别选择m/z 254和m/z 188作为母离子,选择合适的二次电离电压后, 子离子中丰度最高的离子为m/z239和m/z 160。因此最后确定采用m/z 239 和m / z 160作为定量子离子,优化后的二次电离电压分别为0.52和0.68 V。
准确添加ITX标准品至空白样品使其终浓度为5.0, 10.0, 20.0, 50.0, 100.0μg/L,按照“1.2”节和“1.3”节步骤操作得到ITX ( 2-, 4-异构体之和)与内标峰面积的比值( y )和ITX的总含量( x )也呈良
好的线性关系,线性方程为y=0-186 2x – 0.1554,r2 为0.9920。信噪比大于10 时, LOQ 为5.0μg/L。添加5.0μg/L的样品和空白样品的GC-MS/MS图谱见图5。
2. 4 实际样品测定
采用该方法对11种不同品牌和类型的乳制品进行了检测(结果见表2) ,发现了4例疑似样品,经过GC-MS/MS确证阳性样品有两例,测得到的ITX浓度分别为105.2μg/L 和132.4μg/L, 说明国内市场的纸质包装材料乳制品中ITX污染问题值得引起人们的关注。
注：在《色谱》2007年1月发表
参考文献:
[ 1 ] Yu J, Zi Y. Ch ina Packaging Indus try (庾晋, 子荫. 中国包装工业) , 2003 (3) : 44
[ 2 ] Yang B P, Cu i J F, Chen J M, Zhou H D. Pa in t & Coa tings
Indus try (杨保平, 崔锦峰, 陈建敏, 周惠娣. 涂料工业) ,2005, 35 (1) : 36
[3 ]Nes tléComp any. Nes tléand the ITX Reca ll. 2005211224. h ttp:/ /www. nes tle. com /Med ia_Cen te r / ITXreca ll23Nov05. htm
[ 4 ] Eu rop e Food Safe ty Au tho rity. EFSA U nde rtakes R isk As2sessm en t on ITX. 2005211224. h ttp: / /www. efsa. eu rop a.eu /p ress_room /p ress_s ta tem en ts /1226_en. h tm l
[ 5 ] GB 968522003.
[ 6 ] Eu rop e Food Safey Au tho rity. Op in ion of the Sc ien tific Pan2e l on Food Add itives, F lavou rings, P rocess ing A ids and Ma2te ria ls in Con tac t w ith Food on a Reques t from the Comm is2s ion Re la ted to 22Isop rop yl Th ioxan thone ( ITX) and 22E th2ylhexyl242D im e thylam inobenzoa te ( EHDAB ) in Food Con2tac t Ma te ria ls. 2005212207. h ttp: / /www. efsa. eu rop a. eu /en / sc ience / afc / afc_op in ions /1256. h tm l
[ 7 ] Comm iss ion D ec is ion 2002 /657 /EC. O ff J Eu r Comm un,2002, L221 /8
